2025年5月8日是第32个“世界地中海贫血日”，今年的主题为“防控地贫，携手同行”。集萃南宫28ng作为全球领先的小鼠模型服务商之一，将在本文带您走进地中海贫血和相关药物研发的那些事。
地中海贫血（thalassemia，简称地贫）是严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，主要表现为α或β珠蛋白合成或功能障碍，导致红细胞破坏加速、无效造血和铁超负荷，严重影响患者生活质量。
一般轻型的地贫不需要特殊的治疗，中间型和重型地贫主要依赖规律输血和铁螯合剂治疗，唯一根治手段是造血干细胞移植。随着基因和细胞疗法的不断发展，构建合适的动物模型来研究地贫的发病机制以及评估新疗法的有效性变得尤为重要。集萃南宫28ng已成功构建一系列精准模拟地贫的动物模型，为相关药物研发及细胞基因治疗研究提供了高质量的平台支持，助力攻克地贫难题。
α-地贫由α珠蛋白链合成或功能障碍引起，常见基因缺失导致α与β链不平衡，出现过量的异常血红蛋白H（HbH, β4）或巴特氏血红蛋白（Hb Bart's, γ4）。临床严重程度与功能性α珠蛋白基因拷贝数相关：缺失越多，病情越重。重度α-地贫（如四个α基因全部缺失）会导致胎儿时期死亡（Hb Bart's 水肿胎）。
集萃南宫28ng采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了小鼠两个α珠蛋白基因Hba-a1和Hba-a2，建立α-珠蛋白双基因敲除小鼠模型。通过血常规检测发现，与野生型小鼠相比，Hba-a1&Hba-a2-dKO杂合小鼠的HGB (Hemoglobin, 血红蛋白浓度）、MCV (Mean Corpuscular Volume, 平均红细胞体积)和MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin, 平均红细胞血红蛋白含量)显著降低，RETIC (Reticulocyte Count, 网织红细胞比率)显著升高（图1），血涂片吉姆萨染色进一步证实红细胞形态异常，明显畸形、染色质不均，部分红细胞碎裂溶解，普鲁士蓝染色结果显示杂合小鼠脾脏中有过量铁沉积（图2），完美再现患者的典型病理特征。
图1 Hba-a1&Hba-a2-KO小鼠血常规表型分析
图2 Hba-a1&Hba-a2-dKO小鼠血涂片染色分析及普鲁士蓝染色分析
重度表型（Hb Bart’s胎儿水肿综合征模型）：完全的α珠蛋白双基因敲除（即纯合敲除，小鼠体内无任何α链）在胚胎期具有致死性，相当于人类的Hb Bart’s胎儿水肿综合征。集萃南宫28ng采用胎肝细胞重建模型，将来源于胚胎第13.5天的肝脏造血干细胞移植到经放射线清髓的受体小鼠体内，以在成年小鼠中重建纯合敲除胚胎的造血系统。移植纯合敲除(Hba-/-)胎肝细胞的小鼠（G4组）在移植后第9周，小鼠存活率仅40%（图3a），其肝、脾、肾相对重量均显著高于对照组，提示明显的肝脾肾肿大和可能的髓外造血现象（图3b）。
图3 a) 胎肝细胞重建小鼠生存曲线; b) 胎肝细胞重建小鼠组织重量变化
血液学检查显示G4组外周血重度贫血，RBC (Red Blood Cell Count, 红细胞计数)略有升高，HGB先下降后上升，MCV升高，HCT (Hematocrit, 红细胞压积)升高，MCH先下降后上升，RETIC升高（图4）。这些变化与文献报道的人类重度α-地贫的血液学特征一致。脏器病理方面，G4组小鼠的肝和肾脏也出现显著铁沉积（普鲁士蓝染色阳性信号显著增强），进一步证明了重度无效造血导致的铁过载（图5）。因此该胎肝移植模型在成年小鼠中再现了人类Hb Bart’s水肿胎的血液学和病理特征，可用于评估基因治疗等在体干预对重型α-地贫的疗效。
图4 胎肝细胞重建小鼠血常规表型分析
图5 胎肝细胞重建小鼠普鲁士蓝染色分析
为模拟更全面的α珠蛋白缺失，本模型敲除了小鼠α链基因Hba-x，Hba-a1和Hba-a2。由此建立的三基因敲除模型在纯合状态下杜绝了胚胎到成体阶段所有α珠蛋白链的表达。纯合三敲小鼠在胚胎16.5天即死亡，无法存活至出生——这与人类胚胎在无α链情况下中期流产相符。在杂合状态下（三个基因各敲除一个等位基因），小鼠可存活至成年，用以观察中重度α-地贫表型。
8周龄的三基因敲除杂合小鼠即表现出显著的贫血表型。血常规显示，RBC和HGB水平较正常对照显著降低，MCV、MCH降低且RDW_CV (Red cell Distribution Width-Coefficient of Variation, 红细胞分布宽度-变异系数)和RDW_SD (Red Cell Distribution Width – Standard Deviation, 红细胞分布宽度-标准差)增加，提示小鼠出现小细胞低色素性贫血，红细胞大小不均。同时RETIC增多，反映骨髓的造血反应性增强。这些血液学指标在16周龄时依然与对照组有显著差异，说明贫血在成长过程中持续存在（图6）。该模型为评估胚胎期基因治疗干预提供了平台，例如在孕期对胎儿进行基因补救的疗法，可在此模型验证其对胚胎存活和病理改善的效果。
图6 Hba-a1&Hba-a2&Hba-x-tKO小鼠血常规表型分析
本小鼠模型通过基因敲除同时删除了Hbb-bs和Hbb-bt两个β链基因，以模拟β-地贫。纯合敲除会导致小鼠完全缺乏β链，对应人重型β-地贫；杂合敲除则保留部分β链表达，可对应人中间型或轻型β-地贫。杂合敲除的小鼠在幼龄阶段即表现出小细胞性贫血征象。与正常对照相比，8~10周龄杂合鼠的MCV和MCH显著下降，而RETIC显著升高（图7），提示其红细胞携氧能力降低，骨髓加速释放新生红细胞以补偿。这表明杂合敲除已经引发了β-地贫相关的无效造血和贫血表型。
图7 Hbb-bs & Hbb-bt-dKO小鼠血常规表型分析
杂合β-地贫小鼠的外周血涂片可见红细胞形态异常，明显畸形、染色质不均，部分红细胞碎裂溶解，显示典型的重度地贫患者血液学形态学特征。同时，普鲁士蓝染色显示这些小鼠的脾脏以及肝等器官内有大量铁沉积（图8）。该模型为深入探索β-地贫病理机制及新药筛选提供了重要支持。
图8 Hbb-bs & Hbb-bt-dKO小鼠血涂片染色分析及普鲁士蓝染色分析
集萃南宫28ng在明星产品NCG小鼠上引入了c-kit基因V831M位点的先天突变，导致小鼠自身造血干细胞发育缺陷、红系生成能力降低。NCG-X小鼠表现出轻度贫血，但可存活较长时间（尤其雌鼠寿命>33周）。由于携带c-kit功能缺陷，NCG-X小鼠在接受人源造血干细胞（huHSC）移植时，无需像NCG等常规免疫缺陷鼠那样进行放射清髓预处理，供体人源干细胞无需辐照即可成功植入并生存。这一特性使NCG-X成为一个不经辐照即可进行造血重建的人源化模型平台，避免了辐射对小鼠及移植细胞的影响，大大提高了实验便捷性和可靠性。
NCG-X小鼠能够高效重建人源免疫系统。在不经任何预处理的情况下输入人CD34+造血干细胞后，外周血中人源CD45+白细胞逐渐出现并增长。实验数据显示，在移植后数周内NCG-X外周血中人源免疫细胞比例迅速上升，明显高于未辐照对照组。这一结果证明NCG-X在无需清髓的条件下即可实现高效的人免疫系统重建（图9）。这对研究人免疫细胞发育、功能以及评估免疫疗法具有重要意义。
图9 huHSC-NCG-X人源免疫重建数据
图10 huHSC-NCG-X人源红系重建数据
更具创新意义的是NCG-X模型对人源红细胞生成的支持能力。在NCG-X模型中，通过给予巨噬细胞清除剂（如氯膦酸脂质体，Clodronate liposome，简称Clo-lip）处理，可以去除小鼠的红细胞吞噬功能，使人源红细胞在小鼠体内存活。研究发现，在移植huHSC的NCG-X小鼠中注射Clo-lip后，外周血中逐渐出现了成熟的人红细胞（Glycophorin A阳性），并可在外周循环中检测到稳定的存在。脾脏和肝脏的组织切片免疫组化染色显示，处理后小鼠的脾、肝中有大量人源红细胞浸润（抗人红细胞膜蛋白CD235a染色阳性）（图10），而巨噬细胞标志物F4/80染色信号则显著减少，证明小鼠巨噬细胞被有效清除。这一方法成功突破了鼠体内人红细胞生成的瓶颈。
图11 NCG-X模型助力新药研发
该模型为地贫细胞基因疗法的有效性与安全性评价提供了重要的平台支撑，这一创新平台的成功应用，为客户提供了强大的临床前数据支持，有效推动了IND药物申报（图11），快速推动创新疗法的临床转化。
未来，集萃南宫28ng还将持续优化平台，精进小鼠模型开发，携手全球科研伙伴，共同推动地贫领域的研究突破，共同关注，共同努力，朝着彻底攻克地贫的目标迈进，让更多患者看到治愈的希望。
