2022年10月3日，厦门大学吴乔教授团队在Nature Metabolism在线发表了题为“HK1 from hepatic stellate cell–derived extracellular vesicles promotes progression of hepatocellular carcinoma”的文章。该研究使用来自集萃南宫28ng的Hk1f/f（品系编号：T052189）和Lrat-P2A-iCre（品系编号：T006205）小鼠模型进行研究，结合免疫荧光技术、GST pull-down实验、蛋白质组学分析等多个技术手段，揭示了肝星状细胞中HK1通过胞外囊泡释放后能够加速肝癌进程的机制。同时筛选到一种抑制HCC进展的化合物PDNPA，为HCC的治疗提供一种新策略。
1、TGF-β促纤维化过程中诱导HSCs分泌lEV HK1
为了研究纤维化过程中细胞间交流，研究者在LX-2肝星状细胞中分别提取了胞外大囊泡和胞外小囊泡，进行蛋白质组学分析。通过GO富集分析发现HK1是TGF-β刺激后胞外大囊泡中最为富集的蛋白之一。TGF-β能够促进小鼠肝星状细胞通过胞外大囊泡分泌HK1。研究者利用四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型进行研究，发现纤维化伴随着胞外大囊泡外泌HK1。共聚焦结果显示，TGF-β处理促进了HK1从线粒体向质膜的转移。此外，过量表达TSG101显著增加了胞外大囊泡中HK1的分泌。表明HK1是通过胞外大囊泡从肝星状细胞特异性分泌的，TGF-β诱导线粒体HK1运输到质膜，而TSG101进一步协助HK1通过胞外大囊泡分泌。
图1.TGF-β诱导肝纤维化中lEV HK1的分泌
2、HK1的棕榈酰化促进了HK1靶向质膜的分泌
研究者发现用去棕榈酰化酶抑制剂棕榈抑素B（PalmB）或TGF-β处理能够显著增强HK1棕榈酰化程度，而用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸酯（2-BP）处理，则去除了HK1的棕榈酰化。此外，即使用TGF-β处理，HK1在质膜上的定位仍会被2-BP阻断，而当没有TGF-β处理时，会被PalmB增强。表明TGF-β诱导的棕榈酰化有利于HK1从线粒体转移到质膜，然后通过胞外大囊泡分泌。敲除去棕榈酰化酶ABHD17B能够明显增强HK1的棕榈酰化和分泌，并且影响了TGF-β对HK1的诱导。因此，在肝纤维化过程中，TGF-β通过抑制ABHD17B依赖的HK1的去棕榈酰化来促进HK1的分泌。
图2.TGF-β诱导HK1棕榈酰化并向质膜运输
3、HCC细胞劫持来源于肝星状细胞的lEV HK1以加速糖酵解过程
研究者对CCLE进行分析发现，肝癌细胞表达的HK1水平相对较低。此外，通过共聚焦观察及对肝癌相关模型进行实验发现，HCC细胞中的HK1蛋白可能不是自身表达的，而是来源于对肝星状细胞分泌的lEV HK1的摄取。鉴于HK1在糖酵解中的重要作用，作者研究发现Huh7和HepG2细胞葡萄糖吸收和胞外酸化率（ECAR）明显升高的现象在HK1敲除的情况下没有发生。当重新表达HK1时，可以提高Huh7和HepG2细胞葡萄糖摄取量、ECAR的能力以及细胞增殖情况。此外，用糖酵解抑制剂处理Huh7和HepG2细胞时，lEVs不再促进细胞增殖。表明肝星状细胞释放的HK1通过糖酵解重编程促进HCC细胞的增殖。
图3.HCC细胞劫持来源于肝星状细胞的lEV HK1以促进糖酵解
4、HSC衍生的lEV HK1促进小鼠模型中的HCC进展
为了进一步探索lEV HK1与HCC之间的关系，作者对小鼠肝癌模型进行研究，发现lEV HK1显著促进肿瘤生长，并且伴随着Ki67的蛋白水平升高。通过对Hk1f/f与Gfap-Cre的小鼠进行杂交，得到在肝星状细胞中 特异性敲除Hk1的小鼠（Hk1f/f；Gfap-Cre），其肿瘤生长及HK1和Ki67表达受到抑制。此外，研究者发现肝星状细胞来源的HK1能明显促进肝癌的肺部转移，且转移组织中的HK1表达升高，表明lEV HK1能够促进肿瘤的进展。
图4.不同条件诱导的小鼠模型证明了lEV HK1在促进HCC进展中的作用
5、Nur77抑制HSC分泌lEV HK1以抑制肝癌的发展进程
据报道，孤核受体Nur77可抑制TGF-β诱导的纤维化。研究者通过将Nur77转染到LX-2细胞中证实了这一点。Nur77能够上调ABHD17B表达，敲除Nur77或敲除ABHD17B后，lEV HK1的分泌增多且棕榈酰化增强。表明Nur77抑制lEV HK1棕榈酰化以阻碍 HK1的分泌。研究者利用不同蛋白激酶的抑制剂处理LX-2细胞，发现PI3K-Akt途径的抑制剂LY294002能阻断TGF-β诱导的Nur77的降解。此外，当HK1在肝星状细胞中被特异性敲除时，Nur77的缺失不再影响肿瘤生长。表明Nur77通过抑制肝星状细胞分泌lEV HK1，从而抑制肝癌的发展进程。
图5.Nur77抑制HSC分泌lEV HK1
6、小分子PDNPA靶向Nur77以抑制lEV HK1的分泌
研究者通过筛选发现小分子化合物PDNPA能与Nur77配体结合域结合，由此阻碍了Akt与Nur77的相互作用，并且显著修复TGF-β降低的Nur77蛋白水平，抑制HK1的外泌。此外PDNPA在基因和蛋白水平上恢复了ABHD17B的表达，从而阻止了TGF-β诱导的HK1棕榈酰化和分泌。在小鼠肝细胞癌模型中，PDNPA能够显著减少肿瘤数目及肿瘤组织中HK1和Ki67的表达。在肝星状细胞中 特异性删除Nur77后，PDNPA作用被削弱。因此，PDNPA诱导的Nur77表达的升高通过抑制肝星状细胞分泌lEV HK1从而抑制肝癌的发展进程。
图6.PDNPA诱导Nur77的表达以抑制lEV HK1的分泌
结论
上述研究表明，在肝纤维化过程中，肝星状细胞中TGF-β能通过PI3K-Akt途径诱导Nur77降解，导致ABHD17B的表达受到抑制，因此增强了HK1的棕榈酰化，促进HK1转移到质膜并通过lEVs分泌。而肝星状细胞来源的lEV HK1能够被HCC细胞劫持来促进糖酵解重编程和肝癌的发展进程。此外，研究发现小分子化合物PDNPA靶向Nur77以抑制TGF-β诱导的HK1分泌，从而有效延缓肝癌发病。
补充知识：
肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）主要参与肝脏纤维化，并且与肝细胞癌（HCC）关系密切[1-2]。大多数HCC病例是在严重的肝脏纤维化或肝硬化的情况下发生的。促纤维化细胞因子TGF-β在发育和组织稳态过程中调节着各种过程，在纤维化的肝脏中明显增加以激活肝星状细胞[3]。临床数据显示，活化的肝星状细胞与HCC患者的预后不佳有关，并以多种方式影响HCC的发展[4-5]。胞外囊泡（EVs）在肿瘤微环境的细胞间交流中发挥着关键作用，可作为早期HCC诊断的生物标志物[6-7]。研究EV介导的HCC细胞和肝星状细胞之间的相互作用有望进一步促进临床治疗。糖酵解重编程也是肝脏纤维化的一个重要特征[8]。Hexokinase（HK）是糖酵解的重要限速酶之一，对葡萄糖的利用至关重要。最近，HK1被认为可以促进肿瘤的代谢重编程[9]，然而HK1在HCC进展中的功能尚不明确。
参考文献
[1]Duran, A. et al. p62/SQSTM1 by binding to vitamin D receptor inhibits hepatic stellate cell activity, fibrosis, and liver cancer. Cancer Cell 30, 595–609 (2016).
[2]Yoshimoto, S. et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature 499, 97–101 (2013).
[3]Liu, X., Hu, H. & Yin, J. Q. Therapeutic strategies against TGF-β signaling pathway in hepatic fibrosis. Liver Int. 26, 8–22 (2006).
[4]Han, S. et al. Activated hepatic stellate cells promote hepatocellular carcinoma cell migration and invasion via the activation of FAK-MMP9 signaling. Oncol. Rep. 31, 641–648 (2014).
[5]Lin, N. et al. Activated hepatic stellate cells promote angiogenesis in hepatocellular carcinoma by secreting angiopoietin-1. J. Cell. Biochem. 121, 1441–1451 (2020).
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[7]Li, X. et al. The significance of exosomes in the development and treatment of hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer 19, 1 (2020).
[8]Mejias, M. et al. CPEB4 increases expression of PFKFB3 to induce glycolysis and activate mouse and human hepatic stellate cells, promoting liver fibrosis. Gastroenterology 159, 273–288 (2020).
[9]Amendola, C. R. et al. KRAS4A directly regulates hexokinase 1. Nature 576, 482–486 (2019).
